ph激活剂对酶活性的影响（MOF纳米酶的类谷胱甘肽过氧化物酶活性调控及抗炎应用）

生物体在正常生理代谢过程中会产生一些含氧并且性质活泼的物质，如超氧化物、H2O2等，这些物质被统称为活性氧（ROS）。在正常生理条件下，活性氧的产生与清除处于平衡状态；但在病理条件下，活性氧产生与清除的失衡会加剧炎性疾病恶化。在众多活性氧中，H2O2至关重要。它不仅寿命长，易在脂质膜上扩散与转移，还可产生高度破坏性的羟基自由基。

生物体内天然存在的谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，简称GPx）可以通过催化谷胱甘肽（GSH）将过量的H2O2转化为H2O，降低其对生物体的损伤，因而在众多疾病治疗的研究中得到了广泛关注。但GPx与诸多天然酶一样，受其本身蛋白质结构的影响，在实际应用中存在稳定性差、可用性差等缺点，限制了其进一步发展。

纳米模拟酶（Nanozyme，简称纳米酶）是一类具有类酶特性的纳米材料。在目前众多天然酶模拟物中，纳米酶以其独特的高比表面积、低成本、丰富的表面化学形貌等优势获得了广泛的关注，与其相关的应用研究也日渐增多。然而，现有应用中尚未报道仅利用类GPx纳米酶用于治疗的研究。究其原因是，在现有纳米酶研究中，仅有几种材料被报道具有类GPx酶活性，且其活性一般，因而需要与其他抗氧化剂联合用于治疗。因此，探索开发新型高性能的类GPx纳米酶并将其用于生物医学治疗有深远的临床意义。

近年来，金属有机框架（MOF）在模拟水解酶、过氧化物酶等方面的积极探索为相关领域众多研究者提供了新思路。受此启发，本研究利用与金属蛋白酶具有相似金属-配体相配位的MOF结构，通过改变配体从而制备出一系列具有类GPx活性的MOF纳米酶，并将其用于老鼠耳朵炎症和肠炎的治疗研究。如图1所示，选取莱瓦希尔框架材料（MILs），通过在1,4-苯二甲酸（BDC）配体中引入F、Br、NH2、CH3和OH的取代，从而调控MIL-47(V)-X的类GPx活性，并将其进一步用于体内抗炎治疗。

图1：构建类GPx的MIL-47(V)-X MOF纳米酶用于抗炎治疗的示意图。金属钒与一系列取代的对苯二甲酸配位形成具有类GPx活性的MIL-47(V)-X MOFs (X = F，Br，NH2，CH3，OH和H)。其中，MIL-47(V)-NH2具有最优异的类GPx活性，并被用于进一步的抗炎治疗研究。其优异的抗氧化能力可有效减轻耳朵炎症和肠炎模型中的炎症反应。

MIL-47(V)-X利用微波方法合成，并通过PXRD表征确认其成功制备后（图2A），通过监测烟酰胺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）在340nm处吸光度变化，研究了它们的类GPx活性（图2B）。如图2C、2D中结果显示，每一种MIL-47(V)-X都表现出类GPx活性，且MIL-47(V)-NH2显示最高活性。

图2：(A) MIL-47(V)-X的PXRD表征。(B)类GPx的MIL-47(V)-X MOF纳米酶与谷胱甘肽还原酶偶联催化的反应示意图(GR，PDB ID:3GRS)。(C)在室温下，在含有2 mM谷胱甘肽、0.4 mM过氧化氢和0.4 mM NADPH的50 mM磷酸盐缓冲液(pH = 7.4)条件下，监测340 nm (A340 nm)吸光度随时间的变化，用于表征MIL-47(V)-X MOFs的类GPx催化活性。(D) MIL-47(V)-X的类GPx活性的柱状图比较。空白实验是指在没有MOF的情况下。

基于上述结果以及对底物和催化剂浓度对反应动力学等影响的研究，选择20、50和80µg mL-1 的MIL-47(V)-NH2 MOF纳米酶用于进一步体内、外研究。

在研究MIL-47(V)-NH2 MOF纳米酶的潜在生物应用之前，首先进行体外实验评估其细胞保护作用和体外ROS清除能力（图3A）。首先，进行细胞毒性实验以评估MIL-47(V)-NH2 MOF纳米酶的生物相容性（图3B）。然后，研究了MIL-47(V)-NH2 MOF纳米酶对H2O2诱导的氧化应激的细胞保护能力（图3C）。结果表明，MIL-47(V)-NH2 MOF纳米酶不仅具有良好的生物相容性，还是一种有效的ROS清除剂，可保护细胞免受氧化损伤。

图3：（A）细胞保护示意图。(B)不同浓度MIL-47(V)-NH2 MOF下的细胞存活率。(C)MIL-47(V)-NH2 MOF的细胞保护能力。(D)不同处理下细胞的荧光显微图像。

受到体外实验结果的激励，分别用佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯（PMA）诱导的小鼠耳炎模型和葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的肠炎模型评估了MIL-47(V)-NH2 MOF纳米酶的体内抗炎效果。小鼠耳炎模型实验中，将不同浓度的MIL-47(V)-NH2 MOF皮下注射到发炎的耳朵进行治疗后观察到了活性氧探针DCFH-DA荧光的减少以及耳组织的炎症减轻（图4）；在小鼠肠炎模型实验中，在用MIL-47(V)-NH2 MOF治疗后，小鼠体重逐渐恢复并且观察到炎性细胞因子 IL-1β（图5E）和TNF-α（图5F）的显著下调。在耳炎症模型与肠炎模型中，MIL-47(V)-NH2与活性较低的MIL-47(V)-H纳米酶相比均具有更优异的抗炎效果。同时，治疗中均未发现小鼠心脏、肺、肝脏、脾和肾等其他器官明显损伤。以上结果证明了MIL-47(V)-NH2 MOF纳米酶具有有效缓解炎症的性能，表明其作为一种有效纳米药物用于抗炎治疗的潜力。

图4：(A)耳部炎症模型示意图。(B)不同处理后耳炎症小鼠的活体荧光成像。(C)不同处理后的右耳组织H&E染色图像。

图5：(A)肠炎模型的建立和治疗程序示意图。(B)不同治疗下的每日体重记录。(C)第10天拍摄的肠图像。(D)不同处理下肠组织的H&E染色图像。及不同处理下肠匀浆中(E)白介素-1β和(F)肿瘤坏死因子-α的水平。

研究首次报道了具有类GPx活性的MOF纳米酶。通过将金属钒与取代的对苯二甲酸配位制备出一系列具有类GPx活性的MIL-47(V)-X (X = F，Br，NH2，CH3，OH和H) MOF纳米酶。且以最优性能MIL-47(V)-NH2为例，证明了其在体外清除活性氧和保护细胞免受氧化损伤的功能。这一结果扩展到体内抗炎，进一步证明了类GPx的MIL-47(V)-NH2纳米酶对耳部炎症和肠炎的广谱抗炎作用。同时，高活性MIL-47(V)-NH2的治疗效果优于低活性MIL-47(V)-H。上述研究结果不仅验证了类GPx的纳米酶可以单独应用于抗炎治疗，而且证明了传统的结构-活性关系概念可以应用于基于纳米酶的治疗设计。因此，该工作不仅拓展了仿生MOF的研究，且此类抗氧化纳米酶的开发丰富了目前纳米酶的研究，为纳米酶的设计及仿生研究提供了一种新策略。

来源：南京大学

论文原文

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202010714